隨著(zhù)器官芯片技術(shù)的發(fā)展，其應用仍然存在一定的局限性，大部分生理途徑需要連續介質(zhì)循環(huán)和組織間相互作用，單器官芯片無(wú)法全面反映機體器官功能的復雜性、功能變化和完整性。為適應人體結構復雜性，未來(lái)的研究需要建立更加復雜的多器官微流控芯片（Multi-Organ-Chip, MOC）系統，將幾種器官等同物合并到類(lèi)似人類(lèi)的代謝環(huán)境中，開(kāi)發(fā)動(dòng)態(tài)的實(shí)驗室微生物反應器，進(jìn)行系統的毒性檢測和代謝評估。

 

微流控芯片技術(shù)（Microfluidics）也被稱(chēng)為芯片實(shí)驗室（Lab-On-a-Chip, LOC），涉及物理、化學(xué)、醫學(xué)、流體、電子、材料、機械等多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域。通過(guò)微通道、反應室和其他某些功能部件，對流體進(jìn)行精準操控，對生物、化學(xué)、醫學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成分析，具有液體流動(dòng)可控、集成化、消耗低、通量高、分析快等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應用于生物醫學(xué)和環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域?；谖⒘骺匦酒夹g(shù)的人體器官芯片（Human organs-on-chips）近幾年來(lái)發(fā)展迅速，已經(jīng)實(shí)現肺、腎、腸、肝、心臟、血管、皮膚、大腦、骨骼、乳腺、脾臟、血腦屏障、氣血屏障等芯片的構建，通過(guò)與細胞生物學(xué)、工程學(xué)和生物材料等多種學(xué)科的方法相結合，體外模擬多種活體細胞、組織器官微環(huán)境，反映人體組織器官的主要結構和功能特征。

 

人體不同器官或整個(gè)系統的毒性檢測是藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究的重要部分，傳統的二維細胞培養模式以及動(dòng)物實(shí)驗取得了諸多成就，但受周期、成本、精準度、倫理等因素的限制，難以預測人體對于各種藥物的響應。研究表明：人體器官芯片技術(shù)能準確地控制多個(gè)系統參數，與傳統的毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗相比更能反映人體內真實(shí)情況，在新藥篩選方面更具特異性。因此，利用微加工技術(shù)，建立更接近人體環(huán)境的仿生系統成為體外生理模型的研究熱點(diǎn)。

 

然而，隨著(zhù)器官芯片技術(shù)的發(fā)展，其應用仍然存在一定的局限性，大部分生理途徑需要連續介質(zhì)循環(huán)和組織間相互作用，單器官芯片無(wú)法全面反映機體器官功能的復雜性、功能變化和完整性。為適應人體結構復雜性，未來(lái)的研究需要建立更加復雜的多器官微流控芯片（Multi-Organ-Chip, MOC）系統，將幾種器官等同物合并到類(lèi)似人類(lèi)的代謝環(huán)境中，開(kāi)發(fā)動(dòng)態(tài)的實(shí)驗室微生物反應器，進(jìn)行系統的毒性檢測和代謝評估。

 

本文綜述了近年來(lái)多器官微流控芯片的研究進(jìn)展，并對其發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

 

多器官微流控芯片的設計原理

多器官微流控芯片將不同器官和組織的細胞在芯片上培養，以微通道相連，實(shí)現多器官集成化，以考察其相互作用或建立一個(gè)系統，用于體外藥物篩選。芯片中可集成數個(gè)經(jīng)過(guò)特殊設計的微培養室、灌注通道并同時(shí)培養多種細胞，利用微流控技術(shù)可以產(chǎn)生精確可控的流體剪切力、周期性變化的機械力和溶質(zhì)濃度梯度變化的灌注液。利用這些平臺優(yōu)勢，多器官微流控芯片可以用于細致地分析組織、器官特異性應激反應，例如循環(huán)免疫細胞的募集、對藥物、毒素或其他刺激因素的應答等。除此之外，將多個(gè)模擬不同器官、組織的芯片，按照體內的關(guān)系，用血管內皮組織、血細胞或是流體介質(zhì)將其連接起來(lái)，就能在體外模仿體內不同器官、組織之間的生理作用和藥物分布等。

 

圖1所示為 MOC系統裝置，圖1（a）包括兩個(gè)聚碳酸酯蓋板，PDMS-玻璃芯片用于承載血流回路（粉紅色）和排泄流動(dòng)回路（黃色）；數字分別代表腸道（1），肝臟（2），皮膚（3）和腎臟（4）組織的4個(gè)組織培養隔室。多器官芯片布局的頂視圖示出了血液回路中的3個(gè)測量點(diǎn)（A，B和 C）的位置以及排泄回路中的兩個(gè)測量點(diǎn)（D，E）。該裝置用微泵設備來(lái)控制流體的順時(shí)針和逆時(shí)針流動(dòng)，以微通道相連接，在芯片上培養構建了可容納腸、肝、皮膚、腎4個(gè)器官的MOC系統，通過(guò)兩個(gè)流動(dòng)回路模擬模擬藥物在腸內吸收、肝臟代謝以及腎臟排泄，用于體外檢測候選藥物安全性和有效性評估。應用該系統體外模擬了人體內葡萄糖代謝的環(huán)境，結果顯示芯片“口服”藥物，吸收后藥物通過(guò)模擬的血液循環(huán)，經(jīng)過(guò)肝臟，然后進(jìn)入皮膚和腎臟，到達腎臟器官模型代謝并經(jīng)腎尿液排出，進(jìn)一步驗證了葡萄糖在小腸內的代謝途徑。此外，還有相關(guān)研究共培養神經(jīng)球和肝球體，構建神經(jīng)系統-肝臟多器官微流控芯片，用2，5-己二酮研究其對組織的毒性作用和代謝途徑，通過(guò)測定葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)量作為MOC系統代謝活動(dòng)的指標。在肝中，正己烷可能以解毒途徑或者生物活化途徑代謝為己醇，經(jīng)過(guò)血液到達大腦產(chǎn)生毒害作用，實(shí)驗中對兩種不同濃度的2，5-己二酮的毒性測定結果表明其誘導了神經(jīng)球和肝微組織中的高度細胞凋亡。

 

圖1 多器官微流控芯片設計示意圖

 

多器官微流控芯片系統研究

微細胞培養物類(lèi)似物（μCCA）與PBPK模型

 

藥代動(dòng)力學(xué)模型（Physiologically Based Pharmacokinetics, PBPK）是指一種更符合藥物在體內動(dòng)態(tài)變化的具體狀況的模型，對于新藥研發(fā)具有重要作用。PBPK模型以“生理學(xué)室”代替經(jīng)典模型中的隔室（房室模型），根據質(zhì)量平衡關(guān)系、按模型建立速度方程、對方程組進(jìn)行求解、得出各個(gè)組織或器官的毒物濃度與時(shí)間的關(guān)系，可基本明確藥物在體內動(dòng)態(tài)增加或減少的實(shí)際情況。由于微流體可以精確控制多個(gè)隔室的流動(dòng)和連接，區域化的微流體系統可以作為PBPK模型的體外平臺。

 

經(jīng)過(guò)對多器官微流控芯片系統的研究，開(kāi)發(fā)了一種模擬人類(lèi)對藥物反應的高通量體外系統，將基于微流控芯片的微細胞培養物類(lèi)似物（Microscale Cell Culture Analog, μCCA）與PBPK模型結合使用，建立對應PBPK數學(xué)模型的物理裝置（μCCA裝置）。在裝置中，每個(gè)器官代表一個(gè)隔室，代表關(guān)鍵器官的腔室被制造在硅芯片上，并通過(guò)微通道相互連接用于模擬血液流動(dòng)中的介質(zhì)再循環(huán)，μCCAs縮小器件可以在體外模擬近生理流體流動(dòng)條件、體內組織的尺寸比以及多組織器官的相互作用，通過(guò)使用外部泵和外部常見(jiàn)的介質(zhì)再循環(huán)來(lái)支持個(gè)體肝臟、骨髓和腫瘤細胞系培養隔室之間的相互作用。在對肝臟、骨髓和腫瘤細胞系共培養研究中，根據人類(lèi)組織數據設置縮放細胞室及相關(guān)參數，μCCA裝置中不同組織或者器官分別以單獨的隔室相連接來(lái)模擬多組織器官的作用環(huán)境。實(shí)驗結果顯示，μCCA裝置能夠捕獲肝臟隔室中的代謝，可以觀(guān)察到傳統孔板測定中未觀(guān)察到的腫瘤細胞的損傷。

 

結合PBPK預測的μCCA裝置可以與人體試驗的藥物處理匹配，不僅能模擬動(dòng)態(tài)的多器官相互作用，并且還能夠模擬現實(shí)的生理微環(huán)境，實(shí)現體外研究藥物的藥代動(dòng)力學(xué)等藥效學(xué)性質(zhì)。μCCA裝置的微環(huán)境是基于一個(gè)簡(jiǎn)化的PBPK數學(xué)模型設計的，在研究藥代動(dòng)力學(xué)、不同器官細胞間互作及毒性和代謝相互作用的假設檢驗等方面有重要意義。不足的是，當細胞以流體連接的方式培養時(shí)，培養基在提供營(yíng)養物質(zhì)、去除細胞廢物的同時(shí)，也可能會(huì )放大未知灌注液對隔室細胞的毒性作用。

 

多通道三維微流控細胞培養系統（3D-μFCCS）

 

由于μCCA裝置的不足，要設計一個(gè)體內高度保守的系統，重要的是以流體聯(lián)系的方式培養多種細胞類(lèi)型，同時(shí)保持彼此間的隔離，據此開(kāi)發(fā)了一種多通道3D微流控細胞培養系統（3D microfluidic Cell Culture System, 3D-μFCCS）。

 

3D-μFCCS是由多個(gè)微通道相互連接的微流體通道和微陣列組成，采用微陣列技術(shù)對多種細胞類(lèi)型進(jìn)行高密度物理固定，以獲得最大的細胞-細胞相互作用。在3D球形微組織和微流控技術(shù)進(jìn)行多組織實(shí)驗分析中，將預先形成的球形微組織裝載到微室中并在連續灌注下培養，通過(guò)自動(dòng)化的芯片傾斜由重力驅動(dòng)的流動(dòng)產(chǎn)生，而不需要額外的管道和外部泵。以3D-μFCCS為基礎構建的鼠肝和大腸腫瘤MOC系統在前體藥物環(huán)磷酰胺存在下培養8d，僅在芯片上不同微量組織類(lèi)型的共培養物中觀(guān)察到對腫瘤生長(cháng)有顯著(zhù)影響，而環(huán)磷酰胺處理的靜態(tài)肝臟微組織的不連續轉移上清液并不顯著(zhù)影響腫瘤生長(cháng)。該系統驗證了環(huán)磷酰胺對腫瘤生長(cháng)有顯著(zhù)的影響，但在體外無(wú)抗腫瘤活性，只有在肝臟被生物活化之后才起作用。

 

此外，多通道3D-μFCCS還被設計用于同時(shí)培養不同器官的細胞聚集體以模擬身體中的多個(gè)器官。培養4種不同的細胞類(lèi)型，以模擬人類(lèi)的4種器官：C3A（肝臟），A549（肺臟），HK-2（腎臟）和 HPA（脂肪），通過(guò)補充常見(jiàn)的培養基與生長(cháng)因子來(lái)優(yōu)化細胞功能。在細胞培養過(guò)程中，特異性地將TGF-β1在A(yíng)549室內控制釋放，能增強A549細胞的功能，而C3A、HK-2和HPA細胞的功能不受影響，與模擬單個(gè)組織功能有所不同。3D-μFCCS裝置上，細胞培養隔室之間有限的相互作用類(lèi)似于體內的情況。

 

單向流動(dòng)的生物測定系統及其他MOC系統

 

相比μCCA和3D-μFCCS，Imura及其同事構建的生物測定系統是相對先進(jìn)的版本，它將人類(lèi)的腸道，肝臟和乳腺癌細胞系培養物組合成一個(gè)單一的線(xiàn)性通道，應用單向流動(dòng)而不需要介質(zhì)再循環(huán)。微芯片由載玻片，透氣膜和聚二甲基硅氧烷片組成，其中含有通過(guò)光刻制成的微通道。將Caco-2克隆結腸腺癌細胞在微芯片的膜上培養，模擬藥物的體內腸轉運：環(huán)磷酰胺能透過(guò)腸屏障的，表現出較高的滲透系數，環(huán)磷酰胺不能被腸壁吸收的，表現出較低的滲透系數。滲透測試結果與使用傳統方法獲得的結果一致，而電池消耗減少80%。

 

近年來(lái)，在原有器官芯片系統的基礎上，MOC系統進(jìn)一步發(fā)展完善。Loskill等利用μOrgano系統研究多個(gè)心臟單元，可以單獨加載不同類(lèi)型的細胞，控制分化和發(fā)育的時(shí)間，控制各個(gè)組織的流體連接，即插即用。Maschmeyer等設計了可容納兩個(gè)微生物流體流動(dòng)回路的MOC裝置，首次實(shí)現了腸、肝、皮膚和腎4個(gè)器官組織在微流控芯片上重復培養28d，且所有組織在整個(gè)共培養期間保持高細胞活力和離散的生理組織結構，成功從生理角度證明了腸道的功能以及腎臟的生物屏障。除了腸屏障與腎屏障，多器官微流控芯片還成功地模擬了人體的多個(gè)生物屏障，例如利用Transwell裝置在懸浮于孔中的濾膜上培養細胞模擬血腦屏障進(jìn)行藥物轉運研究及檢測特定標志物的表達，在氣液界面實(shí)現肺上皮細胞與血管內皮細胞共培養的氣血屏障等。

 

多器官微流控芯片的設計及新應用

多器官微流控芯片設計

 

多器官微流控芯片的設計基于PBPK的理念，可利用模型預測人體對藥物的反應以及藥物的作用機制。最常制造的裝置是尺寸在10~200mm之間的微流體通道，隔室的大小根據其功能正確地設計比例，不同的器官功能根據其機制的不同而具有不同的尺度。微流體系統材料通常采用聚二甲基硅氧烷，優(yōu)化后多用多孔性較好的水凝膠，可允許水凝膠支架內的分子擴散。芯片制作后需要鑒定和測量培養的組織在用藥物或工程刺激物處理時(shí)的功能反應，進(jìn)行細胞活力、機械力、電信號檢測以及化學(xué)分析等。

 

目前，設計微流控芯片體系主要使用PBPK模型和PD模型。在PBPK模型中，藥代動(dòng)力學(xué) （Pharmacokinetics, PK）建模的方法用來(lái)設計和操作以再現多器官相互作用。PK建?？闪炕眢w不同部位的藥物量，可用簡(jiǎn)單的術(shù)語(yǔ)來(lái)描述藥物給藥后吸收、分布、代謝和消除的復雜過(guò)程，并深入了解藥物分布動(dòng)力學(xué)。然而，建立一個(gè)生理學(xué)上準確的模型是十分困難的，因此限制了PK建模的廣泛使用。藥效動(dòng)力學(xué)（Pharmacodynamics, PD）建模中藥理學(xué)作用被視為藥物濃度的函數，是針對藥物在體內的藥理作用的研究模型。單獨的PK模型不能闡明時(shí)間-藥效的關(guān)系，單獨的PD模型也不能闡明時(shí)間-濃度的關(guān)系，因此需要結合兩者建立PK-PD模型以研究藥物作用靶部位的濃度-效應-時(shí)間三維關(guān)系。在PBPK-PD模型中，PD模型與PK 模型耦合，使用組合的PK-PD模型來(lái)預測或分析給定劑量藥物的生理效應，綜合PK-PD模型可以評估特定劑量下藥物的生理結果的時(shí)間依賴(lài)性變化，應用性相對較廣泛。

 

多器官微流控芯片的新應用

隨著(zhù)多器官微流控芯片在藥物代謝方面應用研究的深入，也產(chǎn)生了各種新應用，如利用肺器官芯片研究納米材料毒性及代謝。哈佛大學(xué)通過(guò)研究肺對熒光納米顆粒傳遞至肺上皮細胞引發(fā)的一系列毒性反應，來(lái)探究應用于環(huán)境毒理學(xué)的肺芯片系統的潛在價(jià)值，為環(huán)境污染物的體內代謝模擬研究開(kāi)拓了新的視野。

 

與大氣污染物有關(guān)的癌癥病例中，細顆粒物PM2.5起至關(guān)重要的作用，PM2.5可以穿透人體肺屏障并進(jìn)入血液系統引發(fā)各種疾病甚至癌癥。但其在體內的代謝途徑和致癌作用機理尚不明確。而目前研發(fā)的應用于藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)方面的多器官微流控芯片系統為該類(lèi)研究提供了新的技術(shù)上的可能。為研究大氣污染與疾病發(fā)生，目前研發(fā)的肺上芯片系統已經(jīng)能夠測試空氣中的微粒和物質(zhì)對單層細胞或三維細胞聚集體的毒性?；谖⒘骺丶夹g(shù)評估空氣質(zhì)量對人類(lèi)健康的影響，利用器官芯片模擬健康和病態(tài)肺的功能，對空氣傳播的污染物暴露對呼吸系統的短期和長(cháng)期影響進(jìn)行無(wú)動(dòng)物測試。與口服藥的代謝途徑不同，顆粒物在體內的代謝途徑主要有兩種：一是經(jīng)皮膚入血，經(jīng)由心入肺再進(jìn)入體循環(huán)分配到肝和腎；二是經(jīng)肺泡入血進(jìn)入體循環(huán)分配到肝和腎。而未知濃度的真實(shí)大氣顆粒物樣品進(jìn)入體內的分布和代謝由于難以監測，無(wú)法確定其濃度，因此缺乏相應的數學(xué)模型來(lái)進(jìn)行后續的研究和預測，目前多是采用熒光標記的人造顆粒物來(lái)進(jìn)行模擬。因此在肺芯片相關(guān)毒性研究的基礎上，設計合理的真實(shí)反應顆粒物體內代謝的多器官微流控芯片系統，建立完整的模擬顆粒物代謝的體外平臺、精準確定顆粒物代謝途徑、制定精確的代謝模型并進(jìn)一步揭示顆粒物的致癌機理是亟待進(jìn)一步深入研究的重要科學(xué)問(wèn)題。

 

此外，微芯片制造通過(guò)微電子機械系統（Microelectromechanical systems, MSMS）與芯片實(shí)驗室和器官微流控芯片系統相結合，MEMS允許將幾種微小或納米微傳感器、致動(dòng)器、加速度計、熱控制器、微流體推進(jìn)器、微波設備、衛星通信等的各種組件最小化，可用于衛星等航天技術(shù)，也可用于監測沙塵暴或火山活動(dòng)等產(chǎn)生的污染源。

 

展望

微流控技術(shù)由微加工技術(shù)與三維培養相結合產(chǎn)生，在體外細胞培養中潛力較高。多器官微流控芯片技術(shù)可在微尺度對流體精準控制，模擬人體生理環(huán)境，克服了傳統二維細胞培養模式與動(dòng)物實(shí)驗的不足，具有高度仿生性。MOC系統的發(fā)展結合了工程技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可調整流體流動(dòng)和微通道中可控的局部組織-流體比率。MOC技術(shù)旨在建立人工的仿生環(huán)境，在器官-組織水平上模擬，以研究不同器官細胞之間的相互作用、相關(guān)生理代謝途徑以及生理毒性檢測等。

 

人體芯片（Human-on-a-chip）是一種利用微加工技術(shù)，基于MOC系統將多個(gè)器官微流控芯片連用反映人體整體系統的仿真體系。自2011年NIH、FDA和國防部人體芯片專(zhuān)項設立以來(lái)，全世界范圍內掀起了人體芯片的研究熱潮。Human-on-a-chip旨在通過(guò)動(dòng)態(tài)控制細胞微環(huán)境的各種培養條件，在微流控芯片上模擬人類(lèi)多個(gè)器官主要功能，從而達到復原芯片上的“人體”系統。相較于單器官芯片，人體芯片更能全面反映機體器官功能的復雜性、功能變化和完整性，并且應用性更強。

 

目前，基于MOC系統的發(fā)展和完善，已經(jīng)實(shí)現了體外模擬心臟、生物血管、肺癌細胞轉移、 腸道功能和腎臟生物屏障等環(huán)境。雖然MOC克服了傳統二維細胞和動(dòng)物實(shí)驗的諸多不足，但是也面臨芯片設計上器官的縮放、高通量分析、芯片上的檢測分析、疾病模型和細胞來(lái)源等問(wèn)題，在實(shí)驗中涉及到的長(cháng)期的動(dòng)態(tài)營(yíng)養平衡、器官的細胞和組織穩態(tài)、毒性檢測的完整性、檢測方法的特異性和靈敏度、芯片的材料等依舊是MOC系統亟待解決和完善的。此外，MOC在生物學(xué)研究、醫學(xué)、毒性測試、藥物代謝等領(lǐng)域應用比較多，但在進(jìn)入體內的污染物比如顆粒物PM2.5對人體的毒害及體內代謝方面研究極少。相信隨著(zhù)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，MOC系統將廣泛應用于醫學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域，我們離‘Human-on-a-chip’的實(shí)現亦越來(lái)越近。